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瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗常見問題分(fēn)析

發布時間：

2024-01-15 15:07

瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗常見問題分(fēn)析

瓊脂糖凝膠電(diàn)泳已經成為(wèi)一種分(fēn)析鑒定重組DNA分(fēn)子及蛋白質(zhì)與核酸相互作(zuò)用(yòng)的重要實驗手段，也是分(fēn)子生物(wù)學(xué)研究的重要方法，常用(yòng)于DNA分(fēn)型、鑒定DNA、RNA分(fēn)子混合物(wù)、DNA核苷酸序列分(fēn)析等技(jì )術，以瓊脂凝膠作(zuò)為(wèi)支持物(wù)，利用(yòng) DNA 分(fēn)子在電(diàn)場中(zhōng)的電(diàn)荷效應和分(fēn)子篩效應，達到分(fēn)離混合物(wù)的目的。

現在我們一起了解一下瓊脂糖凝膠電(diàn)泳的工(gōng)作(zuò)原理(lǐ)和實驗中(zhōng)常見的問題和解決方法。

  1. 什麽是電(diàn)泳？

電(diàn)泳是一種利用(yòng)電(diàn)流根據DNA、RNA或蛋白質(zhì)的物(wù)理(lǐ)特性（如大小(xiǎo)和電(diàn)荷）來分(fēn)離它們的技(jì )術。

  1. 什麽是瓊脂糖？

瓊脂糖是一種線(xiàn)性多(duō)糖聚合物(wù)，從紅色海藻産(chǎn)物(wù)瓊脂中(zhōng)提取而來。将瓊脂糖粉末加熱到熔點後冷切凝固便會形成良好的電(diàn)泳介質(zhì)，其密度由瓊脂糖的濃度決定。

  1. 什麽是瓊脂糖凝膠電(diàn)泳？

瓊脂糖凝膠電(diàn)泳是一種電(diàn)泳形式，用(yòng)于根據核酸（DNA或RNA）片段的大小(xiǎo)進行分(fēn)離。當施加電(diàn)流時，帶負電(diàn)的DNA/RNA通過瓊脂糖凝膠的孔隙向凝膠帶正電(diàn)的一端遷移，較小(xiǎo)的片段遷移較快。由此産(chǎn)生的條帶可(kě)以用(yòng)紫外線(xiàn)（UV）光來觀察。

  1.  瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗技(jì )巧和注意事項
  • 瓊脂糖凝膠溶液配制時總液體(tǐ)量不宜超過錐型瓶50%容量。否則會溢出。
  • 加熱過程中(zhōng)要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發。
  • 注意不要損傷梳底部的凝膠。一個是在拔梳子的時候，一個是在加樣時。
  • 凝膠濃度越低（非常脆弱且難以處理(lǐ)），分(fēn)辨的片段越大；凝膠濃度越高（很(hěn)脆且可(kě)能(néng)凝固不均勻），分(fēn)辨的片段越小(xiǎo)。所以在制膠的時候要特别注意。
  1. 瓊脂糖凝膠電(diàn)泳常見問題與異常分(fēn)析

Q1：為(wèi)什麽marker條帶非常模糊，無法辨别具(jù)體(tǐ)條帶？

A1：出現上述情況，可(kě)能(néng)有(yǒu)以下幾個原因：

1. marker條帶出現了降解。請确保在使用(yòng)過程中(zhōng)避免核酸酶污染；

2. 電(diàn)泳緩沖液陳舊。電(diàn)泳緩沖液多(duō)次使用(yòng)後，離子濃度降低，pH值上升，緩沖能(néng)力減弱，從而影響電(diàn)泳效果，建議經常更換電(diàn)泳緩沖液；

3. 電(diàn)泳條件不合适。電(diàn)泳時電(diàn)壓應不超過20V/cm，溫度應低于30℃；

4. marker上樣量過多(duō)。請根據說明書選用(yòng)合适上樣量；

5. 凝膠質(zhì)量不好。建議使用(yòng)質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會導緻條帶模糊。

Q2：為(wèi)什麽marker條帶出現不規則的條帶（如啞鈴狀等）？
A2：出現上述情況，多(duō)與以下幾個原因有(yǒu)關：

1. 電(diàn)泳緩沖液陳舊。老化的電(diàn)泳緩沖液離子濃度降低，pH值上升，緩沖能(néng)力減弱，從而影響電(diàn)泳效果，建議經常更換電(diàn)泳緩沖液；

2. 電(diàn)泳條件不合适。電(diàn)泳時電(diàn)壓應不超過20V/cm，電(diàn)壓太高可(kě)能(néng)也會導緻marker條帶出現不規則現象。此外，凝膠質(zhì)量差以及凝膠冷卻時凝固不均勻也會導緻該現象出現。

Q3：為(wèi)什麽marker條帶非常弱或者根本沒有(yǒu)條帶？
A3：出現上述情況可(kě)能(néng)是：

1. marker上樣量較低，可(kě)适當增加上樣量；

2. 凝膠質(zhì)量較差或凝膠凝固不均勻也會導緻電(diàn)泳條帶弱或根本沒有(yǒu)條帶；

3. 電(diàn)泳時間過長(cháng)導緻marker條帶跑出凝膠，可(kě)縮短電(diàn)泳時間，降低電(diàn)壓，增加凝膠濃度。
Q4：為(wèi)什麽marker缺帶？
A4：對于含有(yǒu)較小(xiǎo)片段的marker，如果出現缺帶現象，可(kě)能(néng)是因為(wèi)：

1. 小(xiǎo)條帶跑出凝膠或分(fēn)子量大小(xiǎo)非常相近的條帶不易辨認所緻，可(kě)适當縮短電(diàn)泳時間，降低電(diàn)壓，同時增加凝膠濃度；

2. 凝膠中(zhōng)染料含量過低，導緻大片段結合染料量太少或沒有(yǒu)，在藍光儀下亮度太低，可(kě)适當增加染料用(yòng)量。

Q5：加樣孔出現熒光

1. 原因分(fēn)析：大片段DNA的滞留；

2. 解決方法：樣品出現溢出，應該通過降低模闆量或濃度來處理(lǐ)；

Q6：條帶模糊或彌散

1. 原因分(fēn)析：

（1）DNA發生降解；
（2）電(diàn)泳緩沖液陳舊；

（3）電(diàn)泳條件不合适；

（4）核酸樣品純度差，含有(yǒu)DNA結合蛋白或高濃度的鹽分(fēn)；

（5）染色時間過長(cháng)或拍照前放置過久，DNA條帶彌散；

（6）PCR非特異性的擴增；

（7）加樣時操作(zuò)不當，樣品飄出樣孔；

2. 解決方法：

（1）更換緩沖液；

（2）根據凝膠大小(xiǎo)和電(diàn)泳緩沖液類型，使用(yòng)适當的電(diàn)壓進行電(diàn)泳；

（4）電(diàn)泳結束後及時觀察、拍照； 

（5）DNA Maker進行對照，校正是否為(wèi)電(diàn)泳體(tǐ)系的問題；

（6）使用(yòng)特異性較高的引物(wù)；

（7）降低電(diàn)泳時的上樣量，并小(xiǎo)心謹慎操作(zuò)實驗；

                                                                                                                                                      

Q7：無條帶或者弱條帶

  1. 原因分(fēn)析：

（1）DNA的上樣量不夠；

（2）DNA發生降解；

2. 解決方法：

（1）增加上樣量；

（2）防止DNA降解，如：避免反複凍融樣品、避免核酸酶的污染。

         

Q8：DNA Marker降解

  1. 原因分(fēn)析：
  1. 核酸酶污染；
  2. 保存不當；
  1. 解決方法：
  1. 每次吸取時更換滅菌槍頭，勿将電(diàn)泳緩沖液帶入管中(zhōng)、用(yòng)後密閉4°C保存；

（2）4°C 或-20°C保存，避免多(duō)次反複凍融、不可(kě)加熱；

Q9：DNA Marker無正确分(fēn)離

  1. 原因分(fēn)析：
  1. 瓊脂糖質(zhì)量差；        
  2. 電(diàn)泳緩沖液多(duō)次使用(yòng)後失效；
  1. 解決方法：
  1. 使用(yòng)質(zhì)量可(kě)靠的瓊脂糖制膠；
  2. 更換緩沖液；

Q10：條帶缺失

  1. 原因分(fēn)析：
  1. DNA條帶分(fēn)子量過大；
  2. 分(fēn)子量接近的DNA條帶沒有(yǒu)分(fēn)開；
  3. 電(diàn)泳緩沖液使用(yòng)不當；
  4. 電(diàn)泳時間過長(cháng)或電(diàn)壓過高，DNA走出凝膠
  5. 電(diàn)極插反，DNA走出凝膠
  1. 解決方法：
    （1）使用(yòng)脈沖凝膠電(diàn)泳； 

（2）選擇适當的凝膠濃度進行電(diàn)泳；    

（3）SD和TBE緩沖液适于分(fēn)析較小(xiǎo)分(fēn)子量的核酸片段，大片段分(fēn)子不能(néng)完全分(fēn)離；TAE緩沖液不适于分(fēn)離很(hěn)小(xiǎo)的核酸片段；   

（4）縮短電(diàn)泳時間，調整電(diàn)壓；   

（5）正确連接電(diàn)極方向；

Q11：條帶大小(xiǎo)不正确

  1. 原因分(fēn)析：
  1. 核酸降解或形成聚合物(wù)；  

（2）λ DNA酶切Marker的cos位點複性；

（3）相同分(fēn)子量的核酸片段由于結構或序列的差異而有(yǒu)不同的遷移率；

（4）梳子變形，點樣孔不在同一水平線(xiàn)上；

2. 解決方法：
（1）加熱處理(lǐ)或重新(xīn)制備樣品；   

（2）電(diàn)泳前65°C加熱5分(fēn)鍾，冰上冷卻5分(fēn)鍾以後再上樣；   

（3）判斷核酸分(fēn)子是否有(yǒu)特殊結構，如缺口、超螺旋、二聚體(tǐ)等；富含AT堿基的DNA遷移率比同分(fēn)子量富含GC堿基的核酸片段慢；   

（4）使用(yòng)完好的梳子制膠。

Q12：小(xiǎo)片段擴散，條帶模糊，粗

  1. 原因分(fēn)析：
  1. 錯誤選擇了低濃度凝膠，觀察大片段用(yòng)低濃度凝膠,觀察小(xiǎo)片段要用(yòng)高濃度；
  2. 瓊脂糖質(zhì)量不好，質(zhì)量不好的瓊脂糖分(fēn)離小(xiǎo)片段容易擴散,即使是使用(yòng)高濃度凝膠；
  3. 選擇了不合适的電(diàn)泳緩沖液 ； 
  1. 解決方法：
  1. 比如觀察100bp的小(xiǎo)片段用(yòng)2%凝膠跑電(diàn)泳；    
  2. 換用(yòng)質(zhì)量好的瓊脂糖；    
  3. SD和TBE緩沖液适于分(fēn)析較小(xiǎo)分(fēn)子量的核酸片段，大片段分(fēn)子不能(néng)完全分(fēn)離；TAE緩沖液不适于分(fēn)離很(hěn)小(xiǎo)的核酸片段。

Q13：條帶偏移扭曲

  1. 原因分(fēn)析：
  1. 瓊脂糖凝膠配置出現問題；
  2. 凝膠未完全凝固；
  3. 凝膠在電(diàn)泳槽中(zhōng)位置擺放偏移；
  1. 解決辦(bàn)法：
  1. 應準确配置瓊脂糖凝膠，并充分(fēn)進行凝固；
  2. 應固定好凝膠在電(diàn)泳槽中(zhōng)的位置，避免電(diàn)泳過程中(zhōng)出現偏移；

 

上海領駿自主研發的磁珠法核酸提取試劑，可(kě)以提取高質(zhì)量的核酸DNA/RNA，進行瓊脂糖凝膠電(diàn)泳，能(néng)夠得到清晰、明亮、完整的條帶，并且操作(zuò)簡單快速，整個流程基本分(fēn)為(wèi)（裂解結合、洗滌、幹燥、洗脫），大多(duō)數10-30min内即可(kě)完成。可(kě)針對血液、血清/血漿、唾液、細菌、真菌、拭子、糞便、動植物(wù)組織、中(zhōng)草(cǎo)藥、石蠟包埋組織、PCR産(chǎn)物(wù)、測序反應産(chǎn)物(wù)等樣本，分(fēn)離純化高質(zhì)量基因組DNA/RNA、cfDNA、ctDNA或病毒核酸。

圖 新(xīn)鮮yan葉DNA/RNA提取電(diàn)泳圖

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